细胞冻存的注意事项及操作步骤

注意事项:

　　1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80~90%致密度。冷冻前检则细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有之产生。

　　2.细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。

　　3.注意冷冻保护剂之品质。DISO应为试剂级等级，无菌且无色以0. 22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~ 10mI小体积分装，4C避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。

　　在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热里对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高参，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。

　　4.冻存可用10%~90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4 度时)，复苏存活率在80%~90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。

　　2.操作步骤:

　　(1)冷冻前24-48小时更换半里或全里培养基，使细胞处于指数生长期。

　　(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚矾(DMSO)至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。

　　(3)离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少里细胞悬浮液(约0.1m1)计数细胞浓度及冻前存活率。

　　(4)取与细胞悬液等里的冻存液，缓慢逐商加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液( DMSO醉后浓度为5~ 10%)，使细胞浓度为1~5x 10*cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1~ 2nl/mal,并取.少里细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。